植物根系活力檢測試劑盒(TTC 比色法)操作方法

植物根系活力檢測試劑盒(TTC 比色法)

一、產品簡介：

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和代謝水平即根系活力將直接影響植物地上部分的生長和營養狀況以及最終產量，是植物生長的重要生理指標之一。

TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)是一種氧化還原物質，是標準氧化電位為80mV 的氧化還原色素，溶解于水為無色，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯基甲腙(TTF)，TTF比較穩定，不會被空氣中的氧自動氧化，所以TTC 常被用作酶試驗的氫受體。 

植物根系活力檢測試劑盒(TTC比色法)，又稱作植物根系脫氫酶活性檢測試劑盒，其檢測原理是當測定植物根系活力時，以TTC為底物，保溫1~4小時，根系中脫氫酶能夠還原TTC并生成不溶于水的紅色TTF，再用有機溶劑(乙酸乙酯或丙酮等)將其從根中提取出來，用分光光度計或酶標儀檢測485nm處吸光度，進而計算出TTC 的還原量，以該還原量表示脫氫酶活性，并作為植物根系活力的指標。該試劑盒主要用于定量測定植物的根系活力或脫氫酶活性。該試劑盒僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

二、產品組成：

三、自備材料：

1、蒸餾水、乙酸乙酯

2、離心管或容量瓶、濾紙

3、恒溫箱或水浴鍋、研缽或勻漿器

4、分光光度計或酶標儀、比色杯或 96 孔板

四、操作步驟(僅供參考)：

1、配制TTC溶液(0.4%)：稱取0.4gTTC溶解于100ml蒸餾水即成，配制成溶液后應4℃避光保存，若變紅應棄用。
2、配制TTC Assay buffer工作液：將TTC溶液(0.4%)與TTC Assay buffer 等比例混合即成，建議現用現配，4℃避光保存，若變紅應棄用。
3、配制TTF標準工作液：取0.25mlTTC溶液(0.4%)置于10ml離心管或容量瓶，加入少許Na₂S₂O₄粉末(一般2mg左右)，混勻，產生紅色的不溶于水的紅色顆粒物TTF，加10ml乙酸乙酯，充分混合溶解顆粒，靜置分層（下層0.25ml為無色

水層，不可用），上層紅色溶液中TTF濃度為100μg/ml。
按下表分別移取上層紅色溶液0.25、0.5、1、1.5、2ml置于離心管或容量瓶中，用乙酸乙酯補加至10ml，即獲得TTF系列標準管。

4、準備樣品：取0.2~0.5g植物須根系，洗凈，用濾紙吸干，浸沒于TTC Assay buffer工作液中，37℃避光孵育1~3h，加入2ml TTC終止液終止反應。同時做一空白對照實驗，即根系先浸沒于2ml TTC終止液以殺死根樣，再加入10ml TTC Assay buffer工作液，37℃避光孵育1~3h。

5、提取：分別將上述實驗組和空白對照組的根系取出，濾紙吸干水分，放入研缽或勻漿器中，加入3~4ml乙酸乙酯，充分研磨或勻漿，以提取出TTF。把紅色提取液(TTF)轉移至離心管，并用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌2~3次，再將洗滌液一并轉移至離心管，最后補加乙酸乙酯至10ml，搖勻。

6、測定：比色杯光徑1.0cm，系列標準管以“0"號管調零，測定1~5號管485nm的吸光度值；樣品管以空白對照組樣品提取液做參比，調零，以分光光度計或酶標儀測定實驗組樣品提取液在 485nm 的吸光度值。

五、計算：

以系列標準溶液TTF含量(25、50、100、150、200μg)為橫坐標，以對應吸光度為縱坐標，繪制TTF標準曲線，根據回歸方程計算待測樣品的TTF含量或TTC還原量(μg)，即為根系活力或脫氫酶活性。

根系(脫氫酶)活力[mg/(g·h)]=m/(1000×W×t)

式中：

m=根據標準曲線查得的樣品提取液TTF 含量(μg)= TTC 還原量(μg)

W=植物須根系的重量(g)

t=孵育時間(h)

六、注意事項：

1、配制好的TTC溶液(0.4%)和TTC Assay buffer工作液應避光保存，若變紅應棄用。
2、根系種類不同，取樣量可有不同。

3、根系應吸干水分但不能擠壓傷及細胞，才能測定準確。

4、提取用的研缽或勻漿器、試管、比色皿均應保持干燥，沒有水分。

5、由于本實驗采用有機溶劑（乙酸乙酯或丙酮）提取TTF，因此不能用一次性塑料比色皿或者酶標條進行檢測。建議用石英比色皿或玻璃比色皿檢測，檢測完成后用乙醇清洗并用水沖洗干燥即可。

6、如果沒有分光光度計，也可以使用酶標儀測定，但應注意酶標板每孔檢測體積。

7、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。