引物設計和末端標記實驗

試劑、試劑盒激酶緩沖液MgCl2二硫蘇糖醇牛血清白蛋白ddH20TE 緩沖液EDTA聚核苷酸激酶引物放射性化合物

儀器、耗材放射性化合物離心機和轉子丙烯酸防護板離心管架廢棄物容器蓋革計數器QuickSpin 柱

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

5X 激酶緩沖液

0.25mol/LTris-HCl,pH9

0.05mol/LMgCl2

0.05mol/L 二硫蘇糖醇（DTT)

0.25 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA)

-20°C 儲存

滅菌重蒸水（ddH20)

TE 緩沖液，pH8.0

10 mmol/LTris-HCl,pH8.0

1mmol/LEDTA，pH8.0

2. 酶和酶緩沖液

聚核苷酸激酶，10U/ul(Roche)

3. 核酸和寡核苷酸

寡核苷酸引物

4. 放射性化合物

[y-32P]ATP6000Ci/mmol/L(lCi=3.7X1010Bq)(PerkinElmerLifeSciences)

也可用 [y-33P]ATP, 它相對于 [y-32P]ATP 危險性稍微小一些，并具有更長的半衰期，但是更貴。

5. 離心機和轉子

用翻轉吊桶式轉子離心，15 ml 錐形管的適配器

6. 專用設備

丙烯酸防護板、離心管架（「betablock」）和廢棄物容器

離心管架（例如 3008-1000fromUSAScientific)

收集管（1.5 ml，包括快速離心柱）

冷卻塊（coolingblock)

錐形管，15 ml

蓋革計數器（Geigercounter,—種放射能測定器）

離心管，0.5 ml，滅過菌

QuickSpin 柱（TE：),G-25 葡聚糖凝膠（Sephadex) 柱，用于放射性標記 DNA 的純化(Roche)

水浴

二、方法

1. 用滅菌 ddH20 將引物稀釋至10umol/L。所購買的引物是以 50nmol/L 等級合成的收到時呈凍干粉狀。用 PH8.0 的 TE 緩沖液將干粉溶解后，作為儲存液保存。使用前將其稀釋成 10umol/L 的工作溶液，分裝成小份，凍存于-20°C。

2. 選擇一個引物進行末端標記。在冰上融化引物和 5X 激酶緩沖液。酶在加入反應體之前都要放在冰柜里，也可以用臺式冷卻塊使酶維持在-20°C。在室溫下融化同位素，需將丙烯酸防護板擋在前面。

3. 在冰上將 3ul 滅菌 ddH20、5.6ul5X 激酶緩沖液、12ul 10mol/L 引物和 1.4ul 聚苷酸激酶加入到滅菌的 0.5 ml 離心管中，將冰盒放在丙烯酸防護板后面，加入 6ul[y-32P] ATP(6000Ci/mmol/L)。混勻，蓋上蓋子，37°C 水浴上溫育 1~2 h。

4. 在溫育的最后 10min 準備 QuickSpin 柱。將柱子反復顛倒混勻，除去管帽和頂蓋放入收集管內。將柱子/收集管組件置于 15 ml 錐形管中，在臺式離心機中以 1100 g 離心2 min。倒干收集管再離心一次。在裝入末端標記的反應混合物之前，轉移柱到另一干凈的收集管中。

5. 溫育完成之后，將末端標記反應混合物在離心機上短暫離心。加入 52ul 滅菌 ddH20,移液器吹打混勻，轉移所有溶液到離心柱上純化（比如除去未利用的核苷酸)。

6.1100 g 離心 4 min。

7. 從收集管上將柱子取下，并扔入適當的放射性廢棄物容器中。蓋上收集末端標記物的收集管的蓋子。繼續 PCR 方案（方案 2) 或將引物放在試管架上于-20°C 凍存。