口蹄疫O型抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）原理與操作指南

口蹄疫O型抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

通用名：口蹄疫O型抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

英文名：Test Kit for Antibodies to Foot and Mouth Disease Virus Asia O（ELISA）

【包裝規(guī)格】 96T×1/盒、96T×2/盒、96T×5/盒

【預(yù)期用途】 口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）引起的偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，其特征為口腔黏膜、蹄部、乳房皮膚發(fā)生水泡和爛斑。

本試劑用于檢測(cè)牛、羊、豬血清中口蹄疫O型抗體，可用于口蹄疫O型疫苗免疫效果評(píng)價(jià)。

【原    理】

   本試劑盒由預(yù)包被口蹄疫O型抗體的酶標(biāo)板、抗體工作液、抗原液、酶標(biāo)記物及其他配套試劑組成，應(yīng)用阻斷酶聯(lián)免疫法（ELISA）原理檢測(cè)牛、羊、豬血清樣本中口蹄疫O型抗體。實(shí)驗(yàn)時(shí)將稀釋的樣本與抗原液同時(shí)加入酶標(biāo)板中孵育，樣本中的抗體與酶標(biāo)板上的抗體競(jìng)爭(zhēng)抗原，阻斷抗原與板的結(jié)合；經(jīng)洗滌后，再加抗體工作液孵育；經(jīng)洗滌后加入酶標(biāo)記物孵育；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)記物，在孔中加底物液，與酶標(biāo)結(jié)合物反應(yīng)形成藍(lán)色產(chǎn)物，顯色深淺與樣品中的特異性抗體含量成負(fù)相關(guān)；加入終止液終止反應(yīng)后，產(chǎn)物變?yōu)辄S色；用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定各反應(yīng)孔中的吸光值，即可知樣品是否含有口蹄疫O型抗體。

【試劑盒組成】

【儲(chǔ)存及有效期】 2～8℃保存，有效期12個(gè)月。

包被板開(kāi)封后請(qǐng)于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限為2個(gè)月。

【適用儀器】 含450nm、630nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀，37℃恒溫設(shè)備，可調(diào)微量移液器。

【樣品準(zhǔn)備】

1.取動(dòng)物全血按常規(guī)方法制備血清，要求血清清亮，無(wú)溶血、無(wú)污染。樣品1周內(nèi)可于2～8℃保存，長(zhǎng)期需置-20℃保存。

2.用工作洗滌液將待檢牛、羊血清先按32倍稀釋?zhuān)ㄈ?μl血清加入155μl工作洗滌液中，混勻），待檢豬血清按16倍稀釋?zhuān)ㄈ?μl血清加入75μl洗滌液中，混勻），陰、陽(yáng)性對(duì)照不用稀釋。

3.濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫使沉淀溶解，然后用蒸餾水或去離子水作20倍稀釋成工作洗滌液(如19份蒸餾水或去離子水+1份濃縮洗滌液)。

【檢驗(yàn)方法】

1.使用前將試劑盒置室溫30分鐘，恢復(fù)至室溫。

2.取所需用量酶標(biāo)板條，設(shè)陰性/陽(yáng)性對(duì)照各2孔，未用的板條盡快密封，2～8℃保存。

3.陰、陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入陰、陽(yáng)性對(duì)照50μl，樣品孔每孔先加入工作洗滌液25μl，再加入稀釋后的樣品25μl；最后都加入抗原液50μl。

 注：加入抗原后牛、羊樣本稀釋比例相當(dāng)于1:128，豬樣本稀釋比例相當(dāng)于1:64。

4.震蕩混勻10秒，蓋好蓋板膜，置37℃（推薦水浴）避光反應(yīng)30分鐘。

5.甩去孔內(nèi)液體，每孔加350μl工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干。

6.每孔加抗體工作液50μl，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應(yīng)30分鐘。

7.洗滌，同步驟5。

8.每孔加酶標(biāo)記物50μl，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應(yīng)30分鐘。

9.洗滌，同步驟5。

10.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混勻，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應(yīng)15分鐘

11.每孔加終止液50μl，混勻，于450nm(可用630nm作參比波長(zhǎng)）測(cè)定各孔吸光值（A值）。

【參考值】 實(shí)驗(yàn)正常的情況下，陰性對(duì)照A值≥0.8，陽(yáng)性對(duì)照A值≤50%×陰性對(duì)照A值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

1.PI（阻斷率）=（1- 陰性對(duì)照平均A值(樣本A值)）×100%，PI≥50%為陽(yáng)性；PI＜50%為陰性。

2.本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)牛、羊血清結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)表明待檢樣本中含有口蹄疫O型抗體，且效價(jià)高于1:128，達(dá)到保護(hù)水平；反之檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)表明待檢樣本中不含有口蹄疫O型抗體，或效價(jià)低于1:128，未達(dá)到充足保護(hù)水平。

3.本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)豬血清結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)表明待檢樣本中含有口蹄疫O型抗體，且效價(jià)高于1:64，達(dá)到保護(hù)水平；反之檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)表明待檢樣本中不含有口蹄疫O型抗體，或效價(jià)低于1:64，未達(dá)到充足保護(hù)水平。

4.如需了解樣本抗體的最終效價(jià)，可將樣本進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)筆I≥50%的最高稀釋比例即為該樣本抗體的最終效價(jià)。

【試驗(yàn)方法的局限性】

該試驗(yàn)僅作為定性牛、羊、豬血清中口蹄疫O型抗體，根據(jù)PI值高低可作抗體水平強(qiáng)、中、弱的粗略評(píng)估。

該試劑盒不適用于合成肽疫苗免疫抗體效價(jià)評(píng)估。

【注意事項(xiàng)】

1.實(shí)驗(yàn)操作時(shí)需戴手套、穿工作衣，嚴(yán)格健全和執(zhí)行消毒隔離制度，各種實(shí)驗(yàn)廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

2.終止液具有腐蝕性，應(yīng)避免接觸皮膚和衣物，如不慎接觸請(qǐng)立即用大量自來(lái)水沖洗。

3.酶標(biāo)板從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)恢復(fù)至室溫方可開(kāi)袋，未用完的酶標(biāo)板需放入有干燥劑的密封袋中保存。

4.濃縮洗滌液在低溫時(shí)容易結(jié)晶，使用時(shí)需恢復(fù)至室溫以溶解。

5.洗滌時(shí)各孔均需加滿液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。

6.用于檢測(cè)的樣品應(yīng)保持新鮮。

7.試驗(yàn)結(jié)果的判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。

8.不同批號(hào)試劑組分不得混用。