慢病毒載體基礎知識及應用

1.慢病毒載體概述

慢病毒載體（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒載體，是逆轉錄病毒的一種，基因組是RNA，其毒性基因已經被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。可利用逆轉錄酶將外源基因整合到基因組中實現穩定表達，具有感染分裂期與非分裂期細胞的特性。
慢病毒基因組進入細胞后，在細胞漿中反轉錄為DNA，形成DNA整合前復合體，進入細胞核后，DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉錄成mRNA，回到細胞漿中，表達目的蛋白；或產生小RNA。慢病毒介導的基因表達或小RNA干擾作用持續且穩定，并隨細胞基因組的分裂而分裂（圖1）。

 

慢病毒載體具有宿主范圍廣，免疫原性低，基因容量大，可以長期表達等特點。能夠有效地感染培養的腫瘤細胞、肝細胞、心肌細胞、神經元、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞。

慢病毒的感染具有整合特性，能夠將外源基因有效地整合到宿主染色體上，達到持久性表達，因而可構建穩轉細胞株，用于基因的細胞功能研究。使用慢病毒載體改造T細胞可用于CAR-T細胞治療，CRISPR/Cas9文庫構建使用的也是慢病毒載體。

2.慢病毒包裝與純化

慢病毒包裝采用三質粒或四質粒系統進行包裝，收集細胞培養上清，通過超速離心濃縮純化和收集病毒。

3.慢病毒滴度檢測

檢測方法：定量PCR檢測干擾后細胞基因組中外源DNA拷貝數
實驗原理：慢病毒介導外源基因以逆轉錄方式整合進目的細胞基因組

4.慢病毒載體優勢

①  表達時間長：慢病毒可將外源基因整合到宿主細胞基因組上，實現基因長時間穩定的表達，不隨細胞分裂傳代而丟失，是細胞實驗，常用于構建穩轉株
② 安全性高：未發現致病性，慢病毒載體改造T細胞用于CAR-T細胞治療
③ 免疫原性低：直接注射活體組織不易造成免疫反應，適用于動物實驗

5.慢病毒載體應用

5.1 體外感染細胞

慢病毒載體能夠有效地感染培養的腫瘤細胞、肝細胞、心肌細胞、神經元、內皮細胞、干細胞等多種類型原代細胞和大部分細胞系。慢病毒的感染具有整合特性，能夠將外源基因有效地整合到宿主染色體上，因而可以達到持久性表達，從而構建穩定細胞株，用于基因的細胞功能研究。
體外使用慢病毒感染細胞需要注意，由于每種細胞對慢病毒的敏感性不同，有的容易感染，有的比較難，同時每種慢病毒載體熒光強度也有差異，所以正式實驗前需要做病毒感染預實驗來確認MOI值以達到理想的實驗效果。
MOI值是multiplicity of infection 的縮寫，即感染復數，其含義是感染時病毒與細胞的數量比值，一般以實驗中某個細胞，感染達到80%，定義為這個細胞的MOI值，即病毒量與細胞數的比值；加的病毒量(μl)=細胞數×MOI/滴度(…/ml) ×1000
注意：理論上MOI值越高，慢病毒感染上的可能性越大，感染效率越高，但是這樣對細胞的毒性也越大，因此，預實驗確認MOI值要在細胞成活率和感染效率中找到一個平衡點。一般如果MOI超過100，甚至200還感染不是，說明慢病毒非常難感染這株細胞，甚至感染不上，考慮換一種方式，如腺病毒或電轉。

5.2 體內構建成瘤模型

體內應用時，慢病毒可以攜帶目的基因或螢光素酶基因，篩選穩定表達的腫瘤細胞株，直接接種構建皮下成瘤模型，或通過原位或靜脈注射等方式構建轉移模型，活體成像檢測用于研究體內腫瘤的發生發展或轉移等。