RAPA3G Probe qPCR MasterMix試劑

RAPA3G Probe qPCR MasterMix試劑將熱啟動 RAPA3G

DNA 聚合酶、反應 Buffer、dNTP 染料等試劑預混在一起，

是一種 2×濃度的單組分預混試劑。該制品不含有 ROX 校正

染料，適用于各種熒光標記探針，并且適用于各種定量 PCR

機型。優化的反應緩沖液，使得該制品可用于單重及多重的

探針法定量 PCR。

制品中的 RAPA3G DNA 聚合酶為第三代 DNA 聚合酶，

其具有最高的雜質耐受性，其對乙醇、胍鹽、肝素、血清、

植物多糖多酚具有的耐受性，因此可用于粗樣品的直接

定量 PCR 檢測(Direct PCR)。該酶經化學法修飾，在 50℃

以下 100%無活性，只有 95 度條件下加熱 5min 后才能

恢復酶的活力。因此該系統可以有效抑制非特異性 PCR 擴

增，極大的提高了 PCR 擴增特異性。

 由于 RAPA3G DNA 聚合酶對 dUTP 具有的識別能

力，該制品中的 dTTP 核酸堿基被 dUTP 所取代，因此

擴增產物均包含 dUTP，在配合熱敏 UDG（該酶在 95℃熱

變性 5min 后不可逆失活，不影響后續 PCR 反應）的條件下

能達到最佳的防污染能力。在 10e5 copies 污染物的測試條

件下，Ct 推遲 15 個以上（污染去除能力>99.997%）。

包裝

2×RAPA3G Probe MasterMix (with UDG)

A2262A 1 ml

A2262B 25 ml

儲存：-20℃可保存 2 年。短期使用可放置 2-8℃，保存 3 個

月。如出現白色沉淀溶解后使用，不影響反應性能。該試劑

經 30 次凍融后性能無下降，因此不使用時請置于-20℃避光

保存。

RAPA3G DNA 聚合酶對抑制物耐受性

SDS 0.01% Serum 2%

EtOH 5% Plasma Citrate 2%

Heparin 0.1IU/ml Gua SCN 0.25%

Hematin 30μM Trizol 0.5%操作方法

1、按照如下組分配制 20 μl PCR 反應體系：

 終濃度

2×RAPA3G Probe MasterMix(with UDG) 10 μl 1×

Primer F1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM

Primer R1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM

Probe1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM

其它引物和探針 X

DNA 模板 0.5~2 μl

ddH2O Up to 20 μl

2. 進行 Real-Time PCR 反應,通常采用兩步法，程序如下：

Stage 1 25℃ 2 min 去污染

Stage 2 95℃ 5 min 熱啟動

Stage 3

40 循環

95℃ 5 s 變性

60℃ 30 s 收集信號 退火/延伸

注意：退火延伸溫度可在 55-65℃調整

3. 在多數情況下，采用兩步法程序可獲得理想的擴增效果，

在無法達到預期理想效果的情況下，也可采用三步法 PCR

程序，程序如下：

Stage 1 25℃ 2 min 去污染

Stage 2 95℃ 5 min 熱啟動

Stage 3

40 循環

95℃ 5 s 變性

55℃ 10 s 退火

72℃ 30 s 收集信號 延伸

4. 反應結束后確認 Real-Time PCR 的擴增曲線和標準曲

線。R Gre

注意：消化污染步驟中的溫度設置可在 25-37℃之間均可，無顯著

差異，但高于 42℃以上的溫度會導致熱敏 UDG 消化能力急劇下降。

恒溫擴增使用策略及實例展示

應用實例1：A3825-01 紅黃變色反應（肉眼觀察）

以 體外轉錄 RNA 為模板，1-6分別為1、10 、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。 上圖為加樣結束反應起始前，下圖為 65 度反應 30min 后。

應用實例2：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物組進行的LAMP測試。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標準定量PCR儀或恒溫熒光儀上進行反應。以體外轉錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應25min的檢測結果，可以看到檢測反應<20min(達平臺期)。

應用實例3： 用 LP1002引物組進行的LAMP測試。OG變色法為終點變色策略，在反應結束后，倒置反應管，溶解管蓋上染料后，陽性樣本呈現出醒目的綠色，陰性表現出橙色，區分明顯。且該方法不受樣本類型限制，雜質耐受性很好。以體外轉錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應20min后檢測結果。

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